干細胞（Stem cell）即起源細胞。在細胞的分化過程中，細胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機體在發(fā)展適應(yīng)過程中為了彌補這一不足，保留了一部分未分化的原始細胞。因此，干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。

• 能自我更新和分化

• 具自我復制的能力

• 能在一定條件下分化成具有特定形態(tài)和功能的成熟細胞

2、胚胎干細胞

• 從囊胚期胚胎的內(nèi)細胞團獲得

• 胚胎生殖細胞與胚胎干細胞都可自發(fā)分化形成三胚層的全部細胞

3、成體干細胞

• 特定的組織中

• 能自我更新并分化成相應(yīng)組織內(nèi)具有特定功能的成熟細胞

• 可塑性

一、培養(yǎng)條件

1. 環(huán)境：細胞培養(yǎng)需要一個無菌的環(huán)境，所以盡量是在一個獨立的房間里進行。要求配有空氣凈化系統(tǒng)， 能夠?qū)φ麄€房間進行殺菌的紫外燈。

2. 設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、冰箱、水浴鍋、離心機、實驗桌、移液器等。

3. 實驗耗材：一次性的細胞培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)瓶、15ml或50ml離心管、脫脂棉花、封口膜等。

4. 試剤：干細胞對培養(yǎng)條件要求較高，可以根據(jù)自己的條件，盡量選用質(zhì)量好的各種試剤。

試剤的配制：

① DMEM培養(yǎng)基：去離子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3

② MEF培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)基中含10%FBS, 1000u/ml青莓素,1000g/ml鏈霉素

③ ES培養(yǎng)基:ES培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基中含15% FBS, 1000u/ml青莓素，1000g/ml鏈霉素，1mM丙桐酸鈉，0.1mM非必須氨基酸，2mM谷氨酰胺，0.1mM筑基乙醇，1000u/ml白血病抑制因子

④ D-Hank's： 0.8%NaCI，0.04%KCI， 0.035%NaHC03， 0.006%KH2P04，0.005325%Na2HP04, 0.001% 酚紅

⑤ 0.1%明膠:D-HanK's溶液中含0.1%的明膠

⑥ ES細胞凍存酒:90% ES培養(yǎng)基，10% DMSO

⑦ MEF細胞凍存酒：90% MEF培養(yǎng)基，10% DMSO

⑧ Feeder 細胞凍存酒：90% FBS , 10% DMSO

⑨ 絲裂莓素C：根據(jù)產(chǎn)品說明書來配制

二、培養(yǎng)步驟
常見的干細胞培養(yǎng)是勝胎干細胞（ES cells）培養(yǎng)。我們以小鼠的胚胎干細胞培養(yǎng)為例。

1. 小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts, MEF）的復蘇

胚胎干細胞一般是在37℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下，生長在鋪有一層滋養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)皿或者是細胞培養(yǎng)瓶中（此處以細胞培養(yǎng)皿為例）。因此要先鋪滋養(yǎng)層細胞。

① 在37P水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎成纖維細胞。

② 把融化的細胞懸浮酒加到裝有幾毫升預熱好的MEF培養(yǎng)基的無菌離心管中，輕輕混勻后,1000xg , 5min離心收集細胞。

③ 吸掉上清（除去凍存酒中的DMSO）,用10ml預熱的MEF培養(yǎng)基重懸細胞后，加到一個10cm的細 胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

④ 根據(jù)情況對細胞進行換液，大約4天左右，細胞就可以基本長滴整個培養(yǎng)皿，這時可以進行傳代、凍存 或用于制備滋養(yǎng)細胞層。

2. 滋養(yǎng)細胞層（feeder cells layer）的制備

① 把長好的小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)基吸掉，加入10ml新鮮的MEF培養(yǎng)基，并在避光的條件下加入 110μL配好的絲裂莓素C,混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。

② 把含有絲裂莓素C的培養(yǎng)基用無菌的15ml離心管收集起來避光保存，在一周之內(nèi)可再次使用（直接使 用該培養(yǎng)基處理細胞5hh。用PBS（不含二價離子）洗滌細胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消 化細胞，37°C培養(yǎng)箱放置約3min,直到細胞懸浮起來。

③ 用1ml MEF培養(yǎng)基中和胰酶的作用，之后把細胞收集到離心管里，1000xg離心5min。

④ 去掉上清，用1ml MEF培養(yǎng)基重懸細胞，之后把細胞平均分到兩個經(jīng)過0.1 %明膠處理過的細胞培養(yǎng)皿 中，用MEF培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。（明膠處理：加5ml 0.1%的明膠到細胞培養(yǎng)皿中，在37°C培養(yǎng)箱中至少 放10min,之后把明膠吸掉即可）

⑤ 一般處理好的小鼠胚胎成纖維細胞在1~2h之后即可以貼壁，形成滋養(yǎng)細胞層，這時的滋養(yǎng)細胞層即可 用來培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞。制備好的滋養(yǎng)細胞層可以在MEF培養(yǎng)基中保持1周左右的時間，或者是把 細胞凍存。

3. 小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cells, ES cells）的復蘇

① 在37℃水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎干細胞。

② 把融化的細胞懸浮酒加到裝有幾毫升預熱好的ES培養(yǎng)基的無菌離心管中,輕輕混勻后,1000xg , 5min 離心收集細胞。

③ 吸掉上清（除去凍存酒中的DMSO,用10ml預熱的ES培養(yǎng)基重懸細胞后，加到一個10cm的鋪有滋 養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)皿中，放入37°C,含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

④ 根據(jù)情況對細胞進行換液，大約3~4天左右，細胞就可以基本長滴整個培養(yǎng)皿，這時可以進行傳代、凍 存或用于后續(xù)試驗。

4. 小鼠胚胎干細胞的傳代

① 吸掉培養(yǎng)基，用PBS（不含二價離子）洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化細胞，37℃培養(yǎng)箱放 置約5min，直到細胞基本懸浮起來。

② 用1ml ES培養(yǎng)基中和胰酶的作用，之后把細胞收集到離心管里，1000xg離心5min。

③ 去掉上清，用幾毫升ES培養(yǎng)基重懸細胞，之后根據(jù)培養(yǎng)皿規(guī)格和分配比，把細胞按一定比例分到鋪有 滋養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)皿中，加ES培養(yǎng)基培養(yǎng)。ES細胞的分配比可以是1：1到1：10。

5. 小鼠胚胎干細胞的凍存

① 吸掉培養(yǎng)基，用PBS（不含二價離子）洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化細胞，37°C培養(yǎng)箱放 置約5min,直到細胞基本懸浮起來。

② 用1ml ES培養(yǎng)基中和胰酶的作用，之后把細胞收集到離心管里，1000xg離心5min。

③ 去掉上清，用預先配制好的預冷的ES細胞凍存液來重懸細胞（凍存液的量視凍存的細胞量來定，一般 一個長滿的10cm細胞培養(yǎng)皿可以凍存4~6管）,按每管1 ml的量分裝到凍存管中。梯度降溫：4°C20min, -20°C20min, -80°C過夜后迅速轉(zhuǎn)入液氮中。

三、注意事項
1. 絲裂莓素C在操作時要避光，避免其分解。
2. ES細胞傾向于聚集生長，因此在復蘇時，要選擇好培養(yǎng)皿的規(guī)格
3. ES細胞不能長的太滿，應(yīng)避免使各個克隆之間接觸，以免發(fā)上分化。
4. 為避免水或血清帯來的污染，對血清應(yīng)進行支原體檢測，配好的培養(yǎng)基要進行污染測試。


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