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TUNEL凋亡顯色法
TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，DNA內(nèi)切酶被激活，核小體間的基因組DNA被切斷，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）加上帶有生物素（Biotin）標(biāo)記的dUTP即Biotin-dUTP,隨后于辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的streptavidin結(jié)合，在HRP的催化下通過(guò)DAB顯色來(lái)顯示凋亡細(xì)胞，從而可以通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)到細(xì)胞凋亡。
實(shí)驗(yàn)意義
1. TUNEL法是一種分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，可對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞或者凋亡小體進(jìn)行原位染色，可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。
2. 可用于石蠟切片、冰凍切片、培養(yǎng)的細(xì)胞等進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)方法要高。
3. 操作簡(jiǎn)便快捷，在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.石蠟切片TUNEL顯色法：
①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，脫蠟劑二甲苯，至水劑乙醇；
②PBS漂洗3×5 min；
③加入蛋白酶K工作液37℃反應(yīng)15-30 min, PBS漂洗3×5 min；
④4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室溫固定15-30 min，PBS漂洗3×5 min；
⑤浸入封閉液（3%H2O2）室溫封閉10 min，PBS漂洗3×5 min；
⑥加入適量TdT酶反應(yīng)液，暗濕盒中37℃反應(yīng)1 h，用SSC室溫15 min終止反應(yīng)后,PBS漂洗3×5 min；
⑦浸入0.3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min，PBS漂洗3×5 min；
⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反應(yīng)30-60 min，PBS漂洗3×5 min；
⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次；
⑩選擇是否用DAPI復(fù)染細(xì)胞核；
?脫水、透明、中性樹膠封片后進(jìn)行觀察。
2.冰凍切片TUNEL顯色法：
①新鮮組織經(jīng)處理后，立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片，厚度為5~6 μm；
②防脫玻片，貼片，室溫陰干約12 h；
③4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室溫固定10 min，PBS漂洗3×5 min；
④浸入封閉液（3%H2O2）室溫封閉10 min，PBS漂洗3×5 min；
⑤浸入通透液（0.1%Triton X-100溶于PBS中），室溫通透30 S-2 min；
⑥加入適量TdT酶反應(yīng)液，暗濕盒中37℃反應(yīng)1 h，用SSC室溫15 min終止反應(yīng)后,PBS漂洗3×5 min；
⑦浸入0.3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min，PBS漂洗3×5 min；
⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反應(yīng)30-60 min，PBS漂洗3×5 min；
⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次；
⑩選擇是否用DAPI復(fù)染細(xì)胞核；
?脫水、透明、中性樹膠封片后進(jìn)行觀察。
結(jié)果展示
實(shí)驗(yàn)完成周期及交付標(biāo)準(zhǔn)
1. 實(shí)驗(yàn)周期：1-2周
2. 交付標(biāo)準(zhǔn)：蠟塊、切片、染色圖片、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（實(shí)驗(yàn)步驟、試劑、耗材等）
需確認(rèn)的信息
1. 樣本的種屬
2. 樣本的類型（固定的組織or蠟塊or切片）
3. 是否提供試劑盒
4. 拍照要求
參考文獻(xiàn)
[1] Bing L , Ying-Jie X , Xian-Ming C , et al. Molecular mechanism of inhibitory effects of CD59 gene on atherosclerosis in ApoE (-/-) mice[J]. Immunology Letters, 2013, 156(1-2):68-81.
[2] Ozimati A A . Immunodetection of Smad-4 in developing molar roots of alendronate-treated rats[J]. Archives of Oral Biology, 2013, 58(11):1744-1750.
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果：
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晶萊實(shí)驗(yàn)服務(wù)流程
晶萊生物實(shí)驗(yàn)服務(wù)項(xiàng)目
| 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) | 細(xì)胞生物學(xué) | 病理實(shí)驗(yàn) |
| 消化系統(tǒng)模型 | 細(xì)胞培養(yǎng) | 病理染色 |
| 胃酸分泌模型 | 普通細(xì)胞株 | HE染色 |
| 膿毒癥模型 | 細(xì)胞缺氧培養(yǎng) | 油紅O染色 |
| 胃潰瘍模型 | 細(xì)胞培養(yǎng)+支架 | 番紅固綠染色 |
| 胰腺炎模型 | 干細(xì)胞培養(yǎng) | Masson染色 |
| 肝纖維化模型 | 原代細(xì)胞分離/提取/培養(yǎng) | 天狼猩紅染色 |
| DIO肥胖模型 | 細(xì)胞轉(zhuǎn)染/病毒感染 | PAS糖原染色 |
| 膽結(jié)石模型 | Trans well共培養(yǎng) | 阿利新藍(lán)染色 |
| 結(jié)腸炎(UC)模型 | 細(xì)胞增殖 | 甲苯胺藍(lán)染色 |
| 脂肪肝模型 | 細(xì)胞計(jì)數(shù) | 尼氏染色 |
| 急性肝損傷模型 | 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 | LFB髓鞘染色 |
| 免疫、代謝系統(tǒng)疾病模型 | 存活曲線測(cè)定 | 普魯士藍(lán)染色 |
| 骨質(zhì)疏松模型 | ccK-8增殖檢測(cè) | VG染色 |
| 糖尿病模型 | MTT增殖檢測(cè) | EVG染色 |
| 高尿酸血癥模型 | CFSE檢測(cè)增殖-流式檢測(cè) | VonKossa染色 |
| 呼吸系統(tǒng)模型 | BrDU檢測(cè)-免疫熒光法 | 剛果紅染色 |
| 肺纖維化模型 | 細(xì)胞凋亡 | 蘇丹黑B染色 |
| 慢性肺阻塞模型 | Annexin V/PI流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 | Trap染色 |
| 急性肺損傷模型 | WB檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 | 抗酸染色 |
| 哮喘模型 | 透射電鏡觀察凋亡小體 | 革蘭氏染色 |
| 肺栓塞模型 | Tunel染色(POD法,DAB顯色) | AB-PAS染色 |
| 支氣管炎模型 | Tunel(熒光法,含試劑盒) | 亞甲基藍(lán)染色 |
| 泌尿生殖系統(tǒng)模型 | DNA ladder法 | 苯胺藍(lán)染色 |
| 慢性腎衰模型 | 細(xì)胞周期 | 熒光 DAPI染色 |
| 急性腎衰模型 | 細(xì)胞顯微計(jì)數(shù) | 普魯士藍(lán)染色 |
| 腎間質(zhì)纖維化模型 | PI染色 | 間苯二酚堿性品紅染色 |
| 腎結(jié)石模型 | BrdU滲入法 | 銀染 |
| 腎炎模型 | 免疫熒光染色 | 黑色素染色 |
| 子宮內(nèi)膜異位癥模型 | PI流式檢測(cè)細(xì)胞周期 | 鍍銀染色 |
| 心血管系統(tǒng)模型 | 細(xì)胞運(yùn)動(dòng) | PASM 六胺銀染色 |
| 冠心病模型 | Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 | VG染色 |
| 心肌梗死模型 | Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 | 富爾根染色 |
| 心臟驟停模型 | 細(xì)胞劃痕 | 亞甲基藍(lán)染色 |
| 慢性心力衰竭模型 | 細(xì)胞克隆 | 碘-碘化鉀染色 |
| 動(dòng)脈粥樣硬化模型 | 集落形成法/稀釋鋪板方法 | Goldner三色法染色 |
| 白血病模型 | 軟瓊脂克隆法 | PAS-萘酚磺S染色 |
| 高血壓模型 | 毛細(xì)管克隆法 | 改良苯酚品紅染色 |
| 神經(jīng)系統(tǒng)模型 | 體外實(shí)驗(yàn)血管生成 | 網(wǎng)狀纖維染色 |
| 腦卒中模型 | 磁珠分選細(xì)胞 | β-半乳糖苷酶染色 |
| 栓塞性腦梗死模型 | 流式分選細(xì)胞 | 鍍銀染色 |
| 腦出血模型 | 開(kāi)機(jī)費(fèi) | movat五色染色 |
| 腦損傷模型 | 單色 | 維多利亞藍(lán)染色 |
| 脊髓損傷模型 | 雙色 | 免疫組化 |
| 帕金森模型 | CBA多細(xì)胞因子流式檢測(cè) | 免疫組化預(yù)式 |
| 老年癡呆模型 | 組織/血液細(xì)胞制備 | 免疫組化正式 |
| 應(yīng)激模型 | 組織單細(xì)胞制備 | 免疫熒光（石蠟-單標(biāo)） |
| 骨骼疾病模型 | 中性粒細(xì)胞提取 | 免疫熒光（石蠟-雙標(biāo)） |
| 骨折模型 | 其他樣本細(xì)胞制備（如血液等） | 免疫熒光（石蠟-三標(biāo)） |
| 骨缺損模型 | 外周血PBMC分離 | 免疫熒光（冰凍-單標(biāo)） |
| 風(fēng)濕免疫性關(guān)節(jié)炎模型 | 線粒體組學(xué) | 免疫熒光（冰凍-雙標(biāo)） |
| 骨關(guān)節(jié)炎模型 | 線粒體膜電位檢測(cè)-流式法 | 制片前處理 |
| 五官疾病模型 | 線粒體膜電位檢測(cè)-免疫熒光法 | 石蠟組織包埋 |
| 眼科疾病模型 | 線粒體ROS生物含量檢測(cè)--流式 | 特殊包埋（細(xì)胞、材料、眼球等） |
| 鼻腔疾病模型 | 線粒體ROS生物含量檢測(cè)--免疫熒光 | 軟化（肝硬化、皮膚結(jié)痂、植物等） |
| 皮膚疾病模型 | 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP） | 骨組織脫鈣（小） |
| 皮膚損傷模型 | 溶酶體免疫熒光法 | 骨組織脫鈣（大） |
| 腫瘤疾病模型 | 線粒體+溶酶體共定位 | 骨組織EDTA脫鈣（小） |
| 原位瘤模型 | 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) | 骨組織EDTA脫鈣（大） |
| 轉(zhuǎn)移瘤模型 | 線粒體鈣瞬時(shí)變化檢測(cè)-流式 | 石蠟白片 |
| 皮下植瘤模型 | ATP檢測(cè) | 細(xì)胞爬片 |
| ADP檢測(cè) | ||
| AMP檢測(cè) | ||
| 流式 | DNA/RNA半定量檢測(cè) | 基因編輯工具 |
| 組織細(xì)胞懸液處理 | pcr檢測(cè)mRNA | 合成（3保1）片段/質(zhì)粒/引物合成 |
| 細(xì)胞處理 | microRNA檢測(cè) | 質(zhì)粒載體構(gòu)建 |
| 血液標(biāo)本處理 | LncRNA表達(dá)量的檢測(cè) | 過(guò)表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 細(xì)胞刺激培養(yǎng) | CirRNA表達(dá)量的檢測(cè) | shRNA腺病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 單色檢測(cè) | 凝膠電泳 | 過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 雙色檢測(cè) | 基因合成 | shRNA慢病毒載體構(gòu)建包裝 |
| Annexin V/PI凋亡 | ＜300 | 過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 細(xì)胞周期 | 300-1,500 | shRNA腺病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 1500 - 5000 | 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 | |
| >5000 | ||
| 特殊序列 | ||
| ELISA | WB | qPCR |
| 組織勻漿處理 | 蛋白提取及定量一 | RNA抽提 |
| ELISA（不含試劑盒）48T/kit | WB檢測(cè)一（10孔膜/指標(biāo)） | mRNA引物設(shè)計(jì)及合成 |
| ELISA（不含試劑盒）96T/kit | 灰度值分析及作圖一（10孔膜/指標(biāo)） | miRNA引物設(shè)計(jì)及合成 |
| ELISA（含國(guó)產(chǎn)試劑盒）48T/kit | 蛋白提取及定量二 | LncRNA引物設(shè)計(jì)及合成 |
| ELISA（含國(guó)產(chǎn)試劑盒）96T/kit | WB檢測(cè)二（10孔膜/指標(biāo)） | CircRNA引物設(shè)計(jì)及合成 |
| 灰度值分析及作圖二（10孔膜/指標(biāo)） | mRNA RT-qPCR | |
| miRNA RT-qPCR | ||
| LncRNA RT-qPCR | ||
| CircRNA RT-qPCR |
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【平臺(tái)項(xiàng)目開(kāi)展范圍】慢病毒，腺病毒，RNAi類，分子生物實(shí)驗(yàn)，病理實(shí)驗(yàn)，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)，芯片類實(shí)驗(yàn)，并為廣大客戶朋友們提供課題設(shè)計(jì)指導(dǎo)、基金申請(qǐng)指導(dǎo)等服務(wù)。
