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定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實(shí)驗(yàn)中的一種實(shí)驗(yàn)方法。在該方法中，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。隨后，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達(dá)分析、RNA干擾驗(yàn)證、微陣列驗(yàn)證、病原體檢測(cè)、基因測(cè)試和疾病研究。
RT-qPCR可通過(guò)一步法或兩步法來(lái)完成（圖1、表1）。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過(guò)程是在兩個(gè)管中完成，使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計(jì)策略。
圖 1.一步法與兩步法RT-qPCR
表 1.一步法及兩步法RT-qPCR優(yōu)缺點(diǎn)比較
RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程
在設(shè)計(jì)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，決定是否要使用總RNA或純化的mRNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄十分重要。盡管mRNA可能能夠提供略高的靈敏度，但總RNA仍經(jīng)常使用。其原因是總RNA作為起始材料具有較mRNA更重要的優(yōu)勢(shì)。首先，其過(guò)程需要較少的純化步驟，這確保了更好的定量回收模板和更好的把結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為起始的細(xì)胞數(shù)。其次，其避免了mRNA富集步驟，這能夠避免由于不同mRNA的回收率不同而帶來(lái)的結(jié)果偏移的可能性?？偟膩?lái)說(shuō)，由于在大多數(shù)的應(yīng)用中，目標(biāo)基因的相對(duì)定量比檢測(cè)的絕對(duì)靈敏度更為重要，因此在大多數(shù)情況下，總RNA更適用1。
在兩步法中，有三種不同的方法可用于引發(fā)cDNA反應(yīng)：oligo(dT) 引物、隨機(jī)引物、或序列特異性引物（圖2，表2）。通常情況下，是將 oligo(dT) 引物和隨機(jī)引物進(jìn)行混合使用。這些引物退火至模板 mRNA 鏈，并提供給逆轉(zhuǎn)錄酶一個(gè)用于合成的起點(diǎn)位置。
圖 2.兩步法 RT-qPCR 中四種逆轉(zhuǎn)錄引發(fā)方法。
表 2.RT-qPCR 的 cDNA 合成中的引物注意事項(xiàng)。結(jié)合使用隨機(jī)引物與錨定 oligo(dT) 引物可提高逆轉(zhuǎn)錄效率及 qPCR 的靈敏度。
逆轉(zhuǎn)錄酶是利用 RNA 合成 DNA 的一種酶。一部分逆轉(zhuǎn)錄酶具有 RNA 酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解 RNA-DNA 雜交鏈中的 RNA 鏈。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以獲得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。對(duì)于 RT-qPCR 來(lái)說(shuō)，理想的情況下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶，這樣 cDNA 的合成能夠在較高的溫度下進(jìn)行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級(jí)結(jié)構(gòu)的 RNA，同時(shí)保持其在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的全部活性，從而得到更高的 cDNA 產(chǎn)量。
RNase H 能夠從 RNA-DNA 雙鏈中降解 RNA 鏈，從而允許雙鏈 DNA 的有效合成。然而，當(dāng)使用長(zhǎng) mRNA 作為模板，RNA 可能被過(guò)早的降解，從而導(dǎo)致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆過(guò)程中，如果需要合成長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物時(shí)，盡量減小 RNase H 的活性通常是有益的。與此相反，擁有 RNase H 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶通常有利于 qPCR 的應(yīng)用，因?yàn)樗鼈兡軌蛟?PCR 的第一個(gè)循環(huán)中提高 RNA-DNA 雙鏈的熔解（圖3）。
圖 3.逆轉(zhuǎn)錄酶中 RNase H 活性。在 qPCR 中，使用具有 RNA 酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶。
用于 RT-qPCR 中 qPCR 步驟的 PCR 引物最好應(yīng)設(shè)計(jì)成跨越一個(gè)外顯子-外顯子連接，其中一條擴(kuò)增引物可以潛在地跨越實(shí)際外顯子-內(nèi)含子邊界（圖4）。由于含內(nèi)含子的基因組 DNA 序列不會(huì)被擴(kuò)增，因此這種設(shè)計(jì)可以減少?gòu)奈廴镜幕蚪MDNA中擴(kuò)增得到的假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。
如果引物不能被設(shè)計(jì)成能夠分離外顯子或外顯子-外顯子邊界，則有必要利用無(wú) RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶處理 RNA 樣品以除去基因組 DNA 污染。
一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照（-RT對(duì)照）應(yīng)該包括在所有的 RT-qPCR 的實(shí)驗(yàn)中，以檢測(cè) DNA 污染（如基因組 DNA 或來(lái)自之前反應(yīng)的 PCR 產(chǎn)物）。這一對(duì)照包含除逆轉(zhuǎn)錄酶之外的所有反應(yīng)組分。由于該對(duì)照不會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄，因此如果觀察到 PCR 擴(kuò)增，則極有可能來(lái)自 DNA 的污染。
圖 4.RT-qPCR 中 qPCR 步驟的引物設(shè)計(jì)。1）如果一個(gè)引物被設(shè)計(jì)為跨越外顯子-內(nèi)含子邊界，則可能造成污染的基因組 DNA 將不會(huì)被擴(kuò)增，其原因是引物不能退火至該基因組 DNA 模板。相反，cDNA 不含任何內(nèi)含子，能夠有效被引物識(shí)別并擴(kuò)增。2）當(dāng)引物側(cè)接一個(gè)長(zhǎng)的內(nèi)含子（例如1 kb），擴(kuò)增反應(yīng)將不會(huì)發(fā)生，因?yàn)槎痰难由鞎r(shí)間僅夠用于擴(kuò)增短的 cDNA，卻不足以擴(kuò)增基因組靶基因。
Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.
晶萊生物服務(wù)流程
晶萊生物實(shí)驗(yàn)服務(wù)項(xiàng)目
| 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) | 細(xì)胞生物學(xué) | 病理實(shí)驗(yàn) |
| 消化系統(tǒng)模型 | 細(xì)胞培養(yǎng) | 病理染色 |
| 胃酸分泌模型 | 普通細(xì)胞株 | HE染色 |
| 膿毒癥模型 | 細(xì)胞缺氧培養(yǎng) | 油紅O染色 |
| 胃潰瘍模型 | 細(xì)胞培養(yǎng)+支架 | 番紅固綠染色 |
| 胰腺炎模型 | 干細(xì)胞培養(yǎng) | Masson染色 |
| 肝纖維化模型 | 原代細(xì)胞分離/提取/培養(yǎng) | 天狼猩紅染色 |
| DIO肥胖模型 | 細(xì)胞轉(zhuǎn)染/病毒感染 | PAS糖原染色 |
| 膽結(jié)石模型 | Trans well共培養(yǎng) | 阿利新藍(lán)染色 |
| 結(jié)腸炎(UC)模型 | 細(xì)胞增殖 | 甲苯胺藍(lán)染色 |
| 脂肪肝模型 | 細(xì)胞計(jì)數(shù) | 尼氏染色 |
| 急性肝損傷模型 | 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 | LFB髓鞘染色 |
| 免疫、代謝系統(tǒng)疾病模型 | 存活曲線測(cè)定 | 普魯士藍(lán)染色 |
| 骨質(zhì)疏松模型 | ccK-8增殖檢測(cè) | VG染色 |
| 糖尿病模型 | MTT增殖檢測(cè) | EVG染色 |
| 高尿酸血癥模型 | CFSE檢測(cè)增殖-流式檢測(cè) | VonKossa染色 |
| 呼吸系統(tǒng)模型 | BrDU檢測(cè)-免疫熒光法 | 剛果紅染色 |
| 肺纖維化模型 | 細(xì)胞凋亡 | 蘇丹黑B染色 |
| 慢性肺阻塞模型 | Annexin V/PI流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 | Trap染色 |
| 急性肺損傷模型 | WB檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 | 抗酸染色 |
| 哮喘模型 | 透射電鏡觀察凋亡小體 | 革蘭氏染色 |
| 肺栓塞模型 | Tunel染色(POD法,DAB顯色) | AB-PAS染色 |
| 支氣管炎模型 | Tunel(熒光法,含試劑盒) | 亞甲基藍(lán)染色 |
| 泌尿生殖系統(tǒng)模型 | DNA ladder法 | 苯胺藍(lán)染色 |
| 慢性腎衰模型 | 細(xì)胞周期 | 熒光 DAPI染色 |
| 急性腎衰模型 | 細(xì)胞顯微計(jì)數(shù) | 普魯士藍(lán)染色 |
| 腎間質(zhì)纖維化模型 | PI染色 | 間苯二酚堿性品紅染色 |
| 腎結(jié)石模型 | BrdU滲入法 | 銀染 |
| 腎炎模型 | 免疫熒光染色 | 黑色素染色 |
| 子宮內(nèi)膜異位癥模型 | PI流式檢測(cè)細(xì)胞周期 | 鍍銀染色 |
| 心血管系統(tǒng)模型 | 細(xì)胞運(yùn)動(dòng) | PASM 六胺銀染色 |
| 冠心病模型 | Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 | VG染色 |
| 心肌梗死模型 | Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 | 富爾根染色 |
| 心臟驟停模型 | 細(xì)胞劃痕 | 亞甲基藍(lán)染色 |
| 慢性心力衰竭模型 | 細(xì)胞克隆 | 碘-碘化鉀染色 |
| 動(dòng)脈粥樣硬化模型 | 集落形成法/稀釋鋪板方法 | Goldner三色法染色 |
| 白血病模型 | 軟瓊脂克隆法 | PAS-萘酚磺S染色 |
| 高血壓模型 | 毛細(xì)管克隆法 | 改良苯酚品紅染色 |
| 神經(jīng)系統(tǒng)模型 | 體外實(shí)驗(yàn)血管生成 | 網(wǎng)狀纖維染色 |
| 腦卒中模型 | 磁珠分選細(xì)胞 | β-半乳糖苷酶染色 |
| 栓塞性腦梗死模型 | 流式分選細(xì)胞 | 鍍銀染色 |
| 腦出血模型 | 開(kāi)機(jī)費(fèi) | movat五色染色 |
| 腦損傷模型 | 單色 | 維多利亞藍(lán)染色 |
| 脊髓損傷模型 | 雙色 | 免疫組化 |
| 帕金森模型 | CBA多細(xì)胞因子流式檢測(cè) | 免疫組化預(yù)式 |
| 老年癡呆模型 | 組織/血液細(xì)胞制備 | 免疫組化正式 |
| 應(yīng)激模型 | 組織單細(xì)胞制備 | 免疫熒光（石蠟-單標(biāo)） |
| 骨骼疾病模型 | 中性粒細(xì)胞提取 | 免疫熒光（石蠟-雙標(biāo)） |
| 骨折模型 | 其他樣本細(xì)胞制備（如血液等） | 免疫熒光（石蠟-三標(biāo)） |
| 骨缺損模型 | 外周血PBMC分離 | 免疫熒光（冰凍-單標(biāo)） |
| 風(fēng)濕免疫性關(guān)節(jié)炎模型 | 線粒體組學(xué) | 免疫熒光（冰凍-雙標(biāo)） |
| 骨關(guān)節(jié)炎模型 | 線粒體膜電位檢測(cè)-流式法 | 制片前處理 |
| 五官疾病模型 | 線粒體膜電位檢測(cè)-免疫熒光法 | 石蠟組織包埋 |
| 眼科疾病模型 | 線粒體ROS生物含量檢測(cè)--流式 | 特殊包埋（細(xì)胞、材料、眼球等） |
| 鼻腔疾病模型 | 線粒體ROS生物含量檢測(cè)--免疫熒光 | 軟化（肝硬化、皮膚結(jié)痂、植物等） |
| 皮膚疾病模型 | 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP） | 骨組織脫鈣（?。?/span> |
| 皮膚損傷模型 | 溶酶體免疫熒光法 | 骨組織脫鈣（大） |
| 腫瘤疾病模型 | 線粒體+溶酶體共定位 | 骨組織EDTA脫鈣（?。?/span> |
| 原位瘤模型 | 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) | 骨組織EDTA脫鈣（大） |
| 轉(zhuǎn)移瘤模型 | 線粒體鈣瞬時(shí)變化檢測(cè)-流式 | 石蠟白片 |
| 皮下植瘤模型 | ATP檢測(cè) | 細(xì)胞爬片 |
| ADP檢測(cè) | ||
| AMP檢測(cè) | ||
| 流式 | DNA/RNA半定量檢測(cè) | 基因編輯工具 |
| 組織細(xì)胞懸液處理 | pcr檢測(cè)mRNA | 合成（3保1）片段/質(zhì)粒/引物合成 |
| 細(xì)胞處理 | microRNA檢測(cè) | 質(zhì)粒載體構(gòu)建 |
| 血液標(biāo)本處理 | LncRNA表達(dá)量的檢測(cè) | 過(guò)表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 細(xì)胞刺激培養(yǎng) | CirRNA表達(dá)量的檢測(cè) | shRNA腺病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 單色檢測(cè) | 凝膠電泳 | 過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 雙色檢測(cè) | 基因合成 | shRNA慢病毒載體構(gòu)建包裝 |
| Annexin V/PI凋亡 | ＜300 | 過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 細(xì)胞周期 | 300-1,500 | shRNA腺病毒載體構(gòu)建包裝 |
| 1500 - 5000 | 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 | |
| >5000 | ||
| 特殊序列 | ||
| ELISA | WB | qPCR |
| 組織勻漿處理 | 蛋白提取及定量一 | RNA抽提 |
| ELISA（不含試劑盒）48T/kit | WB檢測(cè)一（10孔膜/指標(biāo)） | mRNA引物設(shè)計(jì)及合成 |
| ELISA（不含試劑盒）96T/kit | 灰度值分析及作圖一（10孔膜/指標(biāo)） | miRNA引物設(shè)計(jì)及合成 |
| ELISA（含國(guó)產(chǎn)試劑盒）48T/kit | 蛋白提取及定量二 | LncRNA引物設(shè)計(jì)及合成 |
| ELISA（含國(guó)產(chǎn)試劑盒）96T/kit | WB檢測(cè)二（10孔膜/指標(biāo)） | CircRNA引物設(shè)計(jì)及合成 |
| 灰度值分析及作圖二（10孔膜/指標(biāo)） | mRNA RT-qPCR | |
| miRNA RT-qPCR | ||
| LncRNA RT-qPCR | ||
| CircRNA RT-qPCR |
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