肝癌在各類致死癌癥中位居第四位，是我國第六大常見癌癥疾病。我國肝癌的發病率位居世界前列，患者預后效果差且致死率高。肝癌治療一般以手術切除和化療聯合為主，多數患者由于其發現病癥時已經處于肝癌中晚期，治療效果并不理想。近年來，盡管肝癌治療方式不斷完善，如手術、微創介入、免疫、靶向治療等，患者5年生存率有了一定提高，但整體治療效果仍不理想。因此，開發新型抗腫瘤藥物以及個體化藥物迫在眉睫，而抗腫瘤藥物從研發到臨床應用腫瘤模型的選擇至關重要。

肝癌研究的傳統模型包括體內模型和體外模型兩種，由于肝臟疾病存在明顯的異質性，而傳統肝癌研究模型對于細胞真實形態、空間結構和細胞微環境無法完全準確反映及表達，故研究結果無法應用到臨床實踐；動物模型的種屬差異性限制了其在臨床研究的延續性。致力于反映人體真實情況的肝癌模型是研究者夢寐以求的目標，類器官作為一種新型體外模型，不僅彌補了傳統模型不準確、不全面、不穩定的缺點，還為肝癌免疫研究和血管生成等微環境研究提供了可能性，并可用于高通量藥物篩選和生物樣本庫的構建。類器官模型將在精準治療與再生醫學方面提供更大的潛力。 

類器官是指由干細胞或器官祖細胞以一種類似體內細胞分化的形式組織成器官特異性的細胞集合。Nuciforo等對于類器官的定義主要有3個基本要求。首先要有一個以上的器官細胞類型；其次需具備該器官的一些功能；最后具有該器官的相對應空間結構。Huch等對類器官提出了一個可能更準確的概念，將類器官定義為一群來自體外的3D細胞群，并且如果是來自于組織的干細胞或者多能干細胞（PSC），還具有自我更新和組織的功能，最終呈現出具有原始器官結構和功能的細胞體系。腫瘤類器官是一種惡性細胞團，且可利用原代惡性細胞保留原代腫瘤的病理學形態特征、基因組與轉錄組特征、藥物敏感性及惡性細胞間異質性，還可以持續增殖。 

機體內細胞處于一個十分復雜的微環境，會受到各種調控，包括細胞內和細胞外的一些化學信號、物理信號，而細胞外基質是這些信號相互作用的關鍵區域。理想的腫瘤模型應能在體外重現體內腫瘤的特征，比如一些基因組特征、組織學形態特點、惡性細胞間異質性及腫瘤微環境。在傳統的培養模型中，僅能構建出單維度細胞間的聯系，而類器官的培養則可有類似體內組織器官的相互作用。目前研究構建出胃、腦、肝臟等多種體外類器官。類器官模擬腫瘤等疾病的發生發展相關研究和類器官藥物敏感性的檢測研究越來越引起學者高度重視。 

類器官所建立的環境復雜且具有生理生物學特征，會影響到諸如細胞形態、活性、細胞增殖與遷移等多個方面。研究表明，如果可將多能干細胞誘導并且分化成器官祖細胞，那么原則上就可以產生相應的類器官。但目前該模型依然存在不足，如無法完全重現體內腫瘤微環境，使其在臨床方面的應用仍然受限。 

肝細胞癌類器官構建實驗步驟

1. 將移液槍頭置于冰上預冷，將基質凝膠在冰上或4°C下解凍，并將24孔細胞培養板預熱至37°C。

2. 收集處于對數生長期的HepG2細胞，用PBS輕輕沖洗，并用胰酶消化細胞。

3. 消化后，制備并收集單細胞懸浮液，以1500轉/分鐘的速度離心3分鐘，棄去上清液，并將細胞在DMEM完全培養基中重懸，調整細胞濃度至1.0×10^6細胞/毫升。

4. 細胞接種：在冰上將解凍的基質凝膠與調整濃度的單細胞懸浮液按1:1比例混合，輕輕吹打混合。使用預冷的200μL移液槍頭，將40-50μL混合單細胞懸浮液垂直滴入預冷的24孔板中，形成拱形的細胞滴。

5. 在37°C、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中穩定30分鐘后，向每個孔中加入500-2mL肝細胞癌類器官完全培養基，繼續培養。

6. 每天觀察并拍照記錄，大約5-7天后可以觀察到均勻的肝細胞癌類器官。

培養5天后來自HepG2細胞系的類器官培養結果。

常見問題解答

1. 在處理基質凝膠時應采取哪些預防措施？

所有操作應在無菌環境中進行，使用預冷的移液管以確保基質凝膠呈均勻的糊狀。

2. 如何分裝、冷凍和使用基質凝膠？

解凍后，Arcegel基質凝膠可以分裝到多個小管中，所有分裝都應使用預冷的冷凍管，快速冷凍并儲存，以避免反復凍融。

3. 在不同孔板中培養類器官需要多少體積的基質凝膠和培養基？

類器官通常在24孔板中以50μl/滴的基質凝膠進行培養，然后加入500~800μl的培養基覆蓋滴液。在96孔板中，使用10μl/滴的基質凝膠，然后加入200μl的培養基覆蓋滴液。在6孔板中，每個孔可以接種多個50μl的滴液，然后加入2~3ml的培養基覆蓋滴液。

肝癌類器官的應用

1. 藥物篩選

藥物篩選是新藥研發的關鍵步驟，而類器官具有穩定的基因組，更接近人體細胞的生理狀態并且更適合于生物轉染和高通量篩選。此外，類器官不僅可以用于藥物研發階段，還可以用于臨床前試藥，通過對患者來源類器官的分析，能夠了解遺傳學變化的原因，為后續治療提供數據支撐。Li等用肝癌類器官進行藥物篩選，從膽管癌手術標本不同位置取材，構建27個肝癌類器官細胞株并用129種抗腫瘤藥物進行篩選，最后僅有一小部分藥物廣泛有效，表明應用肝癌類器官可以達到篩選藥物的作用。由于肝臟是負責藥物代謝的主要器官，肝臟類器官也被用于研究治療帶來的潛在副作用。

2. 疾病建模

由于類器官可以高度模擬組織的生理結構、功能以及發育和分化的過程，不僅可用于研究肝臟腫瘤的起始，還可以研究肝臟腫瘤的微環境，因此肝癌類器官可以作為一種良好的體外預測模型。通過建立類器官生物庫，將患者腫瘤特征與生物庫中的類器官進行對比，從而為患者選擇更為精準的治療方案。

3. 再生醫學

肝移植是治療肝纖維化、肝癌等疾病最有效的方法之一，但適合進行移植的組織缺乏，導致肝移植存在一定局限性，而肝臟類器官的出現為此提供了一種可能性。有學者對肝臟類器官培養體系進行了改進，使其存活率大大增加，還能夠分泌更多的白蛋白。Sampaziotis等建立的不同膽囊區域（肝內膽管、膽總管和膽囊）類器官模型的效果良好，修復了人類肝臟的膽管系統，為臨床研究提供了實驗基礎。 

4. 個性化醫療

個性化醫療也稱為精準醫療。腫瘤具有異質性，從而導致個體差異顯著，對腫瘤藥物的研究難點亦在于此。肝癌類器官較好地解決了該問題，在肝癌類器官培養過程中保存了原始腫瘤基因的特征，故而對臨床腫瘤樣本進行取樣與誘導形成具有該患者腫瘤特征的肝癌類器官，對后續研究與治療都更為便利。將類器官應用于肝癌研究的另一個前沿方向是使用從類器官收集的組學分析來間接指導臨床用藥，通過RNA測序還有代謝組學的分析，可推測藥物對肝癌細胞系的生長是否起到抑制作用，為藥物療效的評價提供依據。 

5 生物標志物

通過分子分析方法，包括蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學，能夠發現一些關鍵的生物標志物，可對輔助診斷和精準醫療起到重要作用。胰腺和結直腸癌患者來源的類器官已經通過組學分析，將遺傳、轉錄信息與藥物作用建立了聯系，但是肝臟類器官由于樣本量小而尚未建立。