膀胱癌類器官是從膀胱癌患者的腫瘤組織中提取細胞，在體外培養形成的三維結構，能夠模擬原發腫瘤的基因突變和表達特征。這些類器官可用于藥物篩選和疾病建模，是研究膀胱癌的重要工具。

一、 傳代膀胱腫瘤類器官

注意:建議當膀胱腫瘤類器官的直徑達到 100-150 μm 時通過。

1. 將 500 μL 膠原酶/分散酶添加到含有腫瘤類器官的 24 孔板中的類器官培養基中。上下移液管基底膜基質和培養基。在 37 °C 下孵育 20 分鐘，然后將細胞收獲到 15 mL 試管中><。 注意:在顯微鏡下檢查從基底膜基質中分離的類器官。如果類器官未從基底膜基質上分離，則增加孵育時間或移液更多次。

2. 加入 5 mL 預熱的 DMEM，在 4 °C 下以 400 x g 離心管 3 分鐘，然后吸出上清液。

3. 使用 1 mL 預熱的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 10 μM Y-27632 重懸沉淀。在 37 °C 水浴中孵育 5 分鐘。用力上下移液細胞，并使用 5 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中和胰蛋白酶。

4. 將試管在 4 °C 下以 400 x g 離心 3 分鐘并吸出上清液。

5. 使用 1 mL 預熱的類器官培養基重懸沉淀，并計數單個腫瘤細胞的數量。

二、. 膀胱類器官的原位移植（圖 1A）

1、準備用于原位移植的膀胱腫瘤類器官

1. 移植前，如上所述，將膀胱腫瘤類器官培養 5-7 天。

2. 將 500 μL 膠原酶/分散酶添加到含有腫瘤類器官的 24 孔板中的類器官培養基中。在基底膜基質和培養基上上下移液。在 37 °C 下孵育 20 分鐘，并將細胞收集到 15 mL 試管中。

3. 加入 5 mL 預熱的 DMEM，在 4 °C 下以 400 x g 離心管 3 分鐘，然后吸出上清液。

4. 用 1 mL DMEM 重懸沉淀，并將溶液轉移到 90 mm 培養皿中。

5. 在顯微鏡下，使用 P10 微量移液器拾取 100-100 個腫瘤類器官200，并將它們收集到冰上的微管中。

6. 將試管在 4 °C 下以 400 x g 離心 3 分鐘，然后小心棄去上清液。

7. 將細胞沉淀保持在冰上，直到小鼠準備好進行手術。

2、粘膜下膀胱壁移植

1. 在實驗前至少 1 周準備一只 8 至 10 周齡的雄性裸鼠 （CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl），以使其適應新環境。手術前 24 小時皮下注射恩諾沙星 （5 mg/kg）。

2. 用肥皂和水清潔工作臺表面。在外科手術前對手術器械進行高壓滅菌，并使用無菌器械進行手術。

3. 將 29 G 胰島素注射器、移液器吸頭和基底膜基質放在冰上。麻醉前皮下注射酮洛芬 （5 mg/kg）。

4. 在誘導室中用 4% 異氟醚麻醉小鼠。一旦達到全身麻醉，將小鼠置于仰臥位，并通過面罩吸入 2% 汽化異氟醚來維持麻醉。 

注意:如果麻醉時間超過 30 分鐘，請使用棉簽將眼藥膏涂抹在雙眼上，以避免角膜干燥。

5. 用無菌紗布涂抹聚維酮碘，并用 70% 乙醇擦拭。每次用新紗布或棉簽重復 3 次。

6. 使用一次性無菌手術單覆蓋肛門和手術區域。

7. 使用解剖顯微鏡進行放大，用無菌手術剪刀在下中線腹部的皮膚和肌肉壁上做一個小的橫向切口（小于 1.5 厘米）。從腹腔露出膀胱，并用浸有鹽水的棉簽支撐它。注意:如果膀胱充滿尿液，輕輕按壓膀胱以略微減壓。

8. 類器官沉淀重懸于 80 μL 含有 50% 高濃度基底膜基質的類器官培養基中（表 1 和材料表）。

9. 解剖顯微鏡下使用 29 G 胰島素注射器將類器官懸浮液注射到膀胱圓頂的前部。

10. 用抗菌可吸收縫合線閉合腹壁內層，然后用 4-0 尼龍縫合線閉合外層。用聚維酮碘和 70% 乙醇對手術部位進行消毒。

11. 讓鼠標在紅外線照射器下恢復 10-15 分鐘。監測鼠標，直到它恢復意識和運動能力。

12. 手術后 1 天，檢查小鼠的一般狀況和吻合口瘺。術后每天一次服用酮洛芬 （5 mg/kg），持續 3 天，術后每天一次治療恩諾沙星 （5 mg/kg），持續 10 天。

13. 當切口部位愈合時（手術后 10-14 天），取下縫合線。在腫瘤類器官注射后 2-3 周內監測小鼠膀胱腫瘤的生長。

14. 如果觀察到膀胱腫瘤生長，則使用二氧化碳吸入對小鼠實施安樂死，并收獲整個膀胱腫瘤。使用冷 DPBS 清洗（圖 1B）。

15. 為了分析膀胱腫瘤組織學，使用蘇木精和伊紅 （H&E） 染色對組織的石蠟包埋切片進行染色（圖 1B）。

圖 1:膀胱腫瘤類器官的原位移植。（A） 膀胱腫瘤類器官原位移植到裸鼠的示意圖。（B） 膀胱腫瘤類器官原位移植小鼠的膀胱和 H&E 染色切片的代表性圖像。中間面板中框區的放大視圖顯示在左側面板中。比例尺 = 500 μm。