宮頸癌類器官（organoids）是指利用宮頸腫瘤細胞等在體外培養(yǎng)出的3D細胞培養(yǎng)物并具有一定的空間結(jié)構(gòu)組織類似物。宮頸癌類器官可以作為疾病模型，相較于傳統(tǒng)2D疾病模型，其在闡明疾病的發(fā)展、穩(wěn)態(tài)性和發(fā)病機理等與體內(nèi)環(huán)境更加接近，能作為宮頸癌治療、診段和發(fā)病機制研究的理想試驗模型。

宮頸癌類器官構(gòu)建實驗步驟

1、取材：標本離體后，盡快取材。采用無菌器械，保證無菌環(huán)境，將腫瘤組織放入含有5 mL的原代組織保存液的 15 mL 離心管中，4℃轉(zhuǎn)運；

2、清洗：在生物安全柜中取出樣品管，去除組織保存液，加入適量冷的添加有雙抗的 PBS，反復清洗后，去除 PBS；

3、重復清洗：重復第 2 步驟 3 次；

4、組織處理：去除 PBS緩沖液后，將組織塊移至10 cm含10 mL冷原代 組織保存液的無菌培養(yǎng)皿中，用無菌眼科顯微剪將組織剪碎（直徑約 0.5mm~1mm）；

5、重復清洗：使用常溫PBS，重復第2步驟3次；

6、收集組織碎片，加入組織消化液消化20~30 min，過70 μm篩網(wǎng)，收集宮頸癌細胞；

7、紅細胞裂解：加入10 mL紅細胞裂解緩沖液，室溫下在翹板搖床上搖10 min；

8、重復清洗：裂解完畢，使用常溫 DMEM/F12，重復第 2步驟3次；

9、類器官種板：調(diào)整細胞密度為2~3×106，與基質(zhì)膠1:1均勻混合，將細胞混懸液以40-60 uL每孔種在24孔板中，37℃放置15~30 min，加入預熱的類器官培養(yǎng)液，每個孔 750 uL；

10、類器官培養(yǎng)：將培養(yǎng)板放在 37℃  CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2天更換培養(yǎng)液。加入培養(yǎng)液時，吸頭朝向側(cè)壁，緩慢加入；

11、類器官觀察：每天觀察類器官并拍照，了解初始類器官數(shù)量、增殖速度、形態(tài)、微生物污染情況等。

實驗結(jié)果

注：P為代次，d為培養(yǎng)天數(shù)

常見問題

 Q ：基質(zhì)膠的操作要注意哪些事項？

所有操作需在無菌環(huán)境下進行，應使用預冷的移液器以保證基質(zhì)膠呈勻漿狀。

Q ：獲取臨床樣本，如何避免污染？

①取材時盡量保證無菌取材；

②提取前可以用含雙抗的PBS浸泡幾分鐘：常見與外界環(huán)境有接觸可能的胃、腸、膀胱等位置腫瘤建議用含3%~5%雙抗的PBS浸泡5-10 min，其他常見腫瘤用含1%~2%雙抗的PBS浸泡5min左右；
③提取細胞過程中所用試劑均加1%雙抗及合適濃度的原代抗生素。

Q ：腫瘤組織采集、保存、運輸注意事項

盡可能多采集腫瘤細胞含量高的腫瘤組織，并縮短組織樣本在空氣中暴露的時間，以減少污染概率；采集的腫瘤組織樣本盡快置于裝有專用樣本保存液的無菌管中，低溫（4 ℃左右）下快速運轉(zhuǎn)至檢測單位（盡量保證采樣后2~4 h內(nèi)送到）。

Q ：病灶和癌旁培養(yǎng)出的類器官有區(qū)別嗎？腫瘤組織的取材部位有什么要求？

有差別，腫瘤本身具有異質(zhì)性，不同來源的類器官之間存在差異是很常見的現(xiàn)象，從形態(tài)上看，原發(fā)病灶來源的類器官比癌旁來源的類器官更具有侵襲性的結(jié)構(gòu)，一般病灶形態(tài)上更加不規(guī)則一些。如果希望在建模或藥物篩選方面盡量減小誤差，可以在活性好的地方多位置取樣。